За пухлинної ДНК, що циркулює в крові, можна дуже рано діагностувати рецидиви раку легенів • В'ячеслав Калінін • Новини науки на "Елементи" • Онкологія, Генетика

За пухлинної ДНК, що циркулює в крові, можна дуже рано діагностувати рецидиви раку легенів

Мал. 1. Моніторинг еволюції раку легенів для раннього виявлення рецидивів після видалення пухлини. У клінічних дослідженнях консорціуму TRACERx (стаття М. Jamal-Hanjani et al. 2017) для ста хворих було проведено повне секвенування кодують областей геному з різних ділянок (1-4) пухлини недрібноклітинного раку легенів, віддаленої хірургічним шляхом. Були ідентифіковані мутації ДНК, присутні в пухлини (позначені кольоровими хрестиками). Серед них були виділені клональні мутації, присутні у всіх клітинах пухлини, і субклональние, що виникли пізніше і присутні лише в деяких ділянках. Для кожного пацієнта було побудовано філіпченкове дерево, що показує еволюцію генома пухлини, накопичення мутацій в процесі її росту. На підставі цих даних Еббош з співавторами (стаття C. Abbosh et al. 2017) розробили тест, в якому аналізувалася циркулює в плазмі крові пухлинна ДНК (ctDNA). Цей тест виявляв рецидиви раку (в даному випадку метастаз, локалізований в іншому легкому) задовго до того, як їх вдавалося знайти за допомогою комп'ютерної томографії. Малюнок з синопсиса до обговорюваних статей вNature

Вчені з британського консорціуму TRACERx отсеквеніровалі ДНК клітин раку легенів з різних ділянок пухлин, віддалених хірургічним шляхом у ста пацієнтів. Їм вдалося простежити еволюцію генома кожної пухлини: були виявлені клональні мутації, з яких починався розвиток раку, і субклональние, що виникали пізніше. Набір мутацій у кожного пацієнта виявився індивідуальним. Знаючи, які мутації шукати, інша група вчених з того ж консорціуму провела моніторинг ДНК, що циркулює в плазмі крові пацієнтів, після видалення пухлин. Це дозволило виявити рецидиви і метастази первинних пухлин задовго до того, як вони ставали видно на томограмах. Обговорювані роботи представляються важливим кроком на шляху до впровадження в клінічну практику ефективних персоналізованих методів діагностики і лікування.

За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я, рак легенів – найчастіша причина смерті від онкологічних захворювань. Найбільш значущим провокуючим його фактором вважається куріння, проте можуть захворіти і люди, які ніколи не курили і не мали очевидних контактів з іншими відомими факторами ризику (азбест, радон та ін.).Щорічно в світі реєструється близько 1,8 млн нових випадків раку легенів і порядку 1,6 млн пацієнтів від нього гинуть.

За гістологічною картиною клітин пухлини рак легенів поділяють на кілька типів. Найчастіший з них (приблизно 80% випадків) – погано піддається лікуванню недрібноклітинний рак легенів, НМРЛ (див. Non-small-cell lung carcinoma, NSCLC). Серед НМРЛ по гістології виділяють плоскоклітинний і крупноклеточний рак, аденокарциному і деякі інші, рідко зустрічаються підтипи. НМРЛ дуже часто дає метастази в різні органи, і кожен рік понад мільйон пацієнтів гинуть від метастазів, а не від первинної пухлини. Превентивна післяопераційна хіміотерапія підвищує виживаність пацієнтів всього на 5%. Це може бути пов'язано з високою генетичною гетерогенністю (див. Genetic heterogeneity) клітин пухлин: по-різному мутував ракові клітини можуть бути чутливі або, навпаки, стійкі до абсолютно різних ліків.

Британський консорціум TRACERx (TRAcking non-small cell lung Cancer Evolution through therapy [Rx]) проводить широкомасштабне дослідження на пухлинах НМРЛ, в якому беруть участь кілька клінік і кілька сот пацієнтів. Його результати для ста пацієнтів опубліковані в роботі M. Jamal-Hanjani et al. в The New England Journal of Medicine. Повний секвенування кодують послідовностей ДНК з різних ділянок віддалених пухлин дозволило виявити мутації, присутні в пухлині кожного хворого. Деякі з них виявлялися практично у всіх ділянках (клональні мутації) – очевидно, тому, що виникли на ранніх стадіях розвитку пухлини. Інші мутації, поряд з клональний, виявлялися лише в деяких ділянках і, отже, виникли пізніше (субклональние мутації). Набори мутацій у різних пацієнтів були індивідуальними.

Як клональних очікувано часто виявлялися мутації генів EGFR, MET, BRAF і TP53, Які відомі як драйвери онкогенеза (тобто пов'язані з ініціацією і розвитком ракових пухлин). Серед субклональних могли бути як мутації, що збільшують злоякісність клітин (тобто їх здатність до неконтрольованого зростання), так і не мають прямого відношення до раку, а що виникли внаслідок загального порушення процесів репарації пошкодженої ДНК. На підставі розподілу мутацій були побудовані філогенетичні дерева, що показують історію зростання і прогресії пухлини на молекулярному рівні (рис. 1, 2).

Мал. 2. Філіпченкове дерево, що показує еволюційні взаємини різних ділянок пухлини і метастази по мутацій, знайденим в первинної пухлини і метастазі одного з пацієнтів. кольорові гуртки – клони мутацій, виявлені в пухлинної ДНК, що циркулює в кровотоці (ctDNA); сірі кружки – не виявлення; великий гурток – клональні мутації. Числа 135, 167 – кількість мутацій; довжина неперекреслених гілок дерева пропорційна кількості мутацій. червоний пунктир – відгалуження до рецидиву (метастази). Кольорові або білі ділянки в прямокутниках позначають пари праймерів, за допомогою яких вдалося виявити відповідно забарвлені мутації. amp – ампліфікація, del – делеція, P1 – первинна пухлина, R1-R5 – ділянки первинної пухлини, М1 – метастаз. Малюнок з обговорюваної статті C. Abbosh et al. 2017

Логічне продовження і розвиток цих досліджень – робота C. Abbosh et al., Також виконана в рамках проекту TRACERx і опублікована в журналі Nature. Простежити еволюцію пухлин НМРЛ в організмі пацієнта в процесі клінічних спостережень і лікування дозволив вже застосовувався раніше, але порівняно новий підхід – рідинна біопсія.При звичайній біопсії лікар бере для дослідження фрагмент ракової пухлини, але при цьому можна отримати інформацію лише про обмеженій ділянці пухлини, а головне, пухлина потрібно спочатку детектувати (наприклад, за допомогою комп'ютерної або магнітно-резонансної томографії). Принцип рідинної біопсії заснований на аналізі циркулюючої в плазмі крові ДНК, цДНК (див. Circulating tumor DNA, ctDNA). Вона з'являється в результаті постійного в організмі розпаду і відновлення тканин. При раку в крові можна знайти не тільки фрагменти ДНК нормальних клітин, але і ДНК відмерлих клітин з різних ділянок пухлини. цДНК теоретично можна секвенувати (визначити нуклеотидну послідовність) і отримати таким чином комплексну інформацію про новоутвореннях, які розвиваються в організмі, – в тому числі і тих, які поки не видно на томограмах.

Труднощі полягали в тому, що цДНК може становити лише менше 1% ДНК, виявленої в плазмі крові. Щоб знайти цю "голку в стозі сіна", англійські вчені цілеспрямовано шукали ті мутації, які були виявлені в результаті секвенування ДНК з різних ділянок раніше видаленої пухлини того ж пацієнта.Автори роботи суттєво вдосконалили процедуру виявлення мутацій. Вони застосували так звану мультиплексную полімеразної ланцюгової реакції для ампліфікації (збільшення кількості, накопичення) цільових фрагментів ДНК з наступним секвенуванням. При цьому в одній реакційній суміші автори ампліфікували і потім секвенували не один, як зазвичай, а відразу кілька фрагментів ДНК. Це значно прискорювало роботу. В даному дослідженні одночасно аналізували до 28 різних фрагментів. А методи високоефективного секвенування (секвенування нового покоління) дозволили вловити і визначити нуклеотидну послідовність мутантного фрагмента ДНК на тлі тисяч нормальних фрагментів.

Для кожного з 96 пацієнтів, що беруть участь в дослідженні, вибрали від 10 до 22 аномалій (точкових мутацій, ділок, ампліфікації генів, перебудов хромосом) з числа виявлених в ДНК видаленої пухлини. Для початку вчені спробували виявити ці аномалії в збереженої плазмі крові, взятої у пацієнтів перед видаленням пухлини. Це частково вдалося зробити: принаймні дві аномалії виявлялися в 48% випадків (46 з 96) і одна аномалія – ​​ще в 12 випадках.Успішність виявлення була різною для різних підтипів НМРЛ: при плоскоклітинному раку, при якому пухлина швидко оновлюється і утворюються її великі некрози, мутації виявлялися в 97% випадків (30 з 31), а при аденокарцинома, в яких некрози не так великі, лише в 19 % (11 з 58) Ці аномалії можна було потім детектувати при наступних рідинних біопсіях.

Для 24 пацієнтів (з тих, у кого в крові, взятої до операції, детектувати цДНК) після операції був проведений моніторинг рецидивів і метастазів шляхом регулярного тестування ДНК з плазми крові. Результат вийшов вельми вражаючим. Незабаром після операції цДНК практично повністю зникала. А рецидиви або метастази можна було виявити за достовірного кількості знову з'являється цДНК в середньому за 70 днів, а в наведеному на рис. 3 випадку навіть за 347 днів до того, як їх виявляла комп'ютерна томографія. Таким чином, рідинна біопсія виявляється набагато більш чутливою, ніж комп'ютерна томографія. Це важливо принаймні з двох точок зору. По-перше, лікування рецидивів потрібно починати якомога раніше. По-друге, результати можуть дозволити визначити, яку саме терапію слід застосувати.Так, для одного з пацієнтів було показано, що рецидивують клітини, що несуть клональную онкогенную амплификацию гена ERRB2. У цьому випадку доцільно застосувати хіміотерапевтичні засоби, ефективно пригнічують продукт цього гена.

Мал. 3. Виявлення мутантною цДНК дозволяє рано розпізнати рецидив раку після операції. Визначалися дві мутації – клональная (блакитні гуртки) І субклональная (червоні трикутники); VAF – variant allele frequency. Після достовірного виявлення рецидиву по клональной мутації (мутантна цДНК становила 0,1% від загальної ДНК плазми) була зроблена комп'ютерна томографія (CT – computed tomography), яка спочатку дала негативний результат (Normal CT) і лише через 347 днів позитивний (R – relapse , «рецидив»). Малюнок з обговорюваної статті C. Abbosh et al. 2017

Ще однією важливою знахідкою авторів виявилася можливість за допомогою рідинної біопсії оцінити розмір пухлини по частоті мутантного варіанта щодо загального обсягу ДНК плазми крові. За зробленими оцінками, частка мутантної ДНК 0,1% відповідає приблизно 300 млн клітин пухлини (рис. 4). Таким чином, рідинна біопсія може дозволити здійснювати оцінку ефективності терапії: якщо розмір пухлини зменшиться, це відіб'ється на кількості цДНК.

Мал. 4. Частота народження мутанта цДНК по відношенню до сумарної ДНК в плазмі крові корелює з величиною пухлини. a. Величина пухлин, визначена за допомогою комп'ютерної томографії, корелює з частотою народження клональних мутацій в ДНК плазми крові (VAF). LUCD – плоскоклітинний рак легенів, LUAD – аденокарцинома легенів, Other – інші типи раку. Червоно-коричнева область показує 95-відсоткові інтервали достовірності. b. Пророкувало частота народження клональних мутацій в ДНК плазми крові при гіпотетичних розмірах пухлин. Малюнок зі статті C. Abbosh et al. 2017

Незважаючи на те що рідинна біопсія з аналізом цДНК показала високу ефективність для моніторингу рецидивів раку, вона поки залишається технічно досить складною (потрібно ампліфікація ДНК, її секвенування), трудомісткою і просто дорогою. Тому говорити про її впровадження в широку медичну практику ще рано. Але вартість біотехнологій, особливо секвенування, постійно знижується, і застосування цього прецизійного індивідуального підходу в клінічній практиці може стати реальним вже в найближчому майбутньому.

джерела:
1) Mariam Jamal-Hanjani, Gareth A. Wilson, Nicholas McGranahan, Nicolai J. Birkbak, Thomas B. K.Watkins, Selvaraju Veeriah, Seema Shafi, Diana H. Johnson, Richard Mitter, Rachel Rosenthal, Max Salm, Stuart Horswell, Mickael Escudero, Nik Matthews, Andrew Rowan, Tim Chambers, David A. Moore, Samra Turajlic, Hang Xu, Siow- Ming Lee, Martin D. Forster, Tanya Ahmad, Crispin T. Hiley, Christopher Abbosh et al. (TRACERx Consortium). Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer // The New Enland Journal of Medicine. 2017. V. 376. P. 2109-2121.
2) Christopher Abbosh, Nicolai J. Birkbak, Gareth A. Wilson, Mariam Jamal-Hanjani et al. (TRACERx Consortium, PEACE consortium). Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution // Nature. 2017. V. 545. P. 446-451.
3) Alberto Bardelli. Medical research: Personalized test tracks cancer relapse // Nature. 2017. V. 545. P. 417-418 (синопсис до обговорюваних статей).

В'ячеслав Калінін


Like this post? Please share to your friends:
Залишити відповідь

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: