Вперше отримано рентгенівське зображення вірусу • Юрій Ерін • Новини науки на "Елементи" • Фізика

Вперше отримано рентгенівське зображення вірусу

Мал. 1. Схема експерименту. Отримане камерою з ПЗС-матрицею зображення мишачого вірусу герпесу за допомогою математичних методів рентгеноструктурного аналізу перетворювалося в розподіл електронної щільності усередині вірусу, що і означало "отримання" рентгенівського знімка. Масштаби і пропорції не дотримано. Мал. з обговорюваної статті arXiv: 0806.2875

Групі вчених з США і Японії вдалося отримати рентгенівське зображення вірусу – з рекордним дозволом 22 нм. Автори сподіваються, що цей дозвіл може бути в подальшому покращено за допомогою проекту X-FEL – рентгенівського лазера на вільних електронах, що дозволить отримувати більш детальні знімки макромолекул.

У 50-ті роки минулого століття дві групи вчених, очолювані одна Джоном Кендрю, інша Максом Перуца, з'ясували структуру гемоглобіну і міоглобіну, опромінюючи їх рентгенівськими променями і використовуючи потім метод рентгеноструктурного аналізу (див. Також X-ray crystallography). З цього моменту рентгенівські промені стали основним "помічником" в дослідженні тривимірних структур макромолекул.

Однак біологічні об'єкти, такі як клітини, органели (грубо кажучи, "органи" клітини), віруси і інші макромолекули, важко піддаються рентгеноструктурному аналізу через неможливість їх кристалізації.Слабким місцем рентгеноструктурного аналізу є також вимога високої якості досліджуваних кристалів, наприклад їх періодичності. Щоб якось обійти ці проблеми, при рентгеноструктурном аналізі частково впорядкованих або невпорядкованих зовсім об'єктів (білків, ДНК, вірусів і т. Д.) Фізики вдаються до так званого методу малокутового розсіювання. Рентгенівське випромінювання в цьому випадку концентрується поблизу первинного пучка – в області малих кутів розсіювання, тобто є слабо розходяться.

В роботі Quantitative Imaging of Single, Unstained Viruses with Coherent X-rays, що з'явилася недавно в архіві препринтів, спільна група вчених із США і Японії повідомила про те, що нею вперше отримано рентгенівське зображення одиничного вірусу. Для цього був використаний так званий рентгенівський дифракційний мікроскоп. Говорячи про "зображенні", автори статті мають на увазі візуалізацію розподілу електронної щільності усередині вірусу – свого роду "фотографію", але тільки не в оптичному діапазоні, а в рентгенівському.

Вченим вдалося отримати висококонтрастне зображення вірусу з майже рекордним дозволом – 22 нанометра (на сьогодні рекордом роздільної здатності рентгенівського дифракційного мікроскопа променів є величина 15 нм, досягнута на початку цього року; див.роботу Nanoscale Imaging of Buried Structures with Elemental Specificity Using Resonant X-Ray Diffraction Microscopy в журналі Phys. Rev. Lett.). Звертає на себе увагу також той факт, що дослідження піддався об'єкт з молекулярної масою на три порядки менше, ніж макромолекули, досліджені раніше. "Сфотографовано" був мишачий вірус герпесу (MHV-68), неактивний імпульсом ультрафіолетового випромінювання і трипроцентним розчином глутаральдегида (це речовина, яка часто використовується для стерилізації медичного обладнання та дезінфекції). Віруси герпесу були розчинені в метанолі з концентрацією близько 20 штук на мікролітр. Цей розчин і був досліджений під рентгенівським дифракційним мікроскопом.

Схема експерименту наведена на рис. 1. Рентгенівське випромінювання з енергією 5 кеВ проходило через отвір розміром 20 мікрометрів, розташоване на відстані близько 1 метра перед досліджуваним об'єктом. Трохи попереду зразка з вірусами розташовувалася кремнієва захисна проріз для блокування "паразитного" оптичного випромінювання, що йде від камери (про неї буде сказано далі). Отримане зображення фіксувалося розташованої в метрі від об'єкта дослідження камерою з ПЗС-матрицею (CCD-камера) з дозволом 1340 × 1300 пікселів (розмір одного пікселя складає 20 мікрометрів).

Для вивчення впливу рентгенівського випромінювання на вірус, тобто з'ясування того, як сильно рентген змінює його внутрішню структуру, попередньо було зроблено три знімки, один з яких наведено на рис. 2a. Акуратне порівняння знімків показало, що поглинена вірусом доза опромінення (3 · 107 Грей) суттєво не змінює "нутрощі" вірусу. На отриманому зображенні також можна побачити, що розмір вірусу становить приблизно 200 нм.

Знімок, отриманий камерою з ПЗС-матрицею, не є головним результатом дослідників. Важливо розуміти, що основні завдання рентгеноструктурного аналізу (зокрема, в цьому експерименті) – це перш за все встановлення розмірів і форми елементарної комірки кристалічної структури речовини і подальше визначення приналежності кристала до однієї з груп симетрії, яких всього налічується 230. Для цього необхідно математично обробити значення інтенсивностей всіх дифракційних відображень від даного об'єкта. Остаточна мета такої обробки полягає в обчисленні за експериментальними даними значень електронної щільності ρ (х, y, z) В будь-якій точці осередку кристала з координатами х, y, z. Так як будова кристала приблизно періодичне, то існує можливість записати електронну щільність в ньому через ряд Фур'є:

Тут V – об'єм елементарної комірки, h, k, l – деякі цілі числа, звані індексами Міллера (грубо кажучи, вони позначають, як розташовуються атомні площини в кристалі), i – уявна одиниця і, нарешті, найважливіше – Fhkl, Коефіцієнти ряду Фур'є, звані структурними амплітудами. Ці математичні "складності" необхідні для того, щоб "підсумувати" дифракційні рентгенівські віддзеркалення і потім отримати зображення мікроструктури кристала, оскільки не існує лінз, здатних фокусувати рентгенівське випромінювання.

Мал. 2. Зображення вірусу, отримане за допомогою камери з ПЗЗ-матрицею (a); рентгенівське зображення вірусу (b); знімок вірусу під скануючим і просвічує електронним мікроскопом (c і d відповідно). Мал. з обговорюваної статті arXiv: 0806.2875

Структурні амплітуди, взагалі кажучи, можуть бути комплексними величинами, тому їх можна представити у вигляді добутку модуля і фази:

Fhkl = |Fhkl| Exp (hkl)

В експерименті по дифракції рентгенівських променів фізично виміряти можна лише модуль |Fhkl|, А точніше, його квадрат |Fhkl|2, Але не фазу. І це головна проблема в рентгеноструктурном аналізі. Існують різні моделі структурної "розшифровки" експериментальних даних. Наприклад, метод проб і помилок. У цьому методі вибирається якась пробна фізична модель, в якій вважаються значення |Fhkl|mod і порівнюються з експериментальними даними |Fhkl|exp. Залежно від значення так званого R-фактора (фактора розбіжність):

запропоновану модель або приймають, або відкидають. Зрозуміло, оптимальний вибір моделі відбувається, коли значення R-фактора дорівнює нулю.

Для більш складних структур, в тому числі і некристалічних, як в описуваної роботі, наприклад, застосовується такий метод "розшифровки" даних: структурні амплітуди і їх фази розглядаються як випадкові величини. Далі виводяться функції розподілу цих випадкових величин, які дають можливість оцінити, з урахуванням експериментальних даних, найбільш імовірні значення фаз. А далі, використовуючи формулу (1), отримують шуканий розподіл електронної щільності, а разом з ним і зображення досліджуваного об'єкта.Тут ми коротко описали далеко не всі методи "розшифровки" даних, але критерієм придатності цих методів в кожному випадку є R-фактор.

У цій роботі для "розшифровки" даних автори користувалися методом під назвою GHIO (guided hybrid input-output algorithm), трохи схожим на метод випадкових величин. Цим методом автори розшифрували 16 дифракційних зображень і серед них вибрали п'ять з найменшим значенням R-фактора. Потім ці п'ять зображень були "усереднені" і таким чином було отримано остаточне зображення (рис. 3a). Оскільки метод, використаний в даному експерименті, грунтувався на випадкових величинах, то автори застосували його ще раз для цих 16 зображень, повторивши процедуру вибірки п'яти кращих зображень і потім їх подальшого усереднення (рис. 3b). За твердженням авторів, відмінність цих малюнків, не перевищує 2,3%, що говорить про коректність цього методу "розшифровки".

Мал. 3. Рентгенівські зображення вірусу, "розшифровані" методом GHIO (див. Опис в тексті). Мале відмінність між зображеннями вказує на коректний аналіз даних електронної щільності усередині вірусу. Мал. з обговорюваної статті arXiv: 0806.2875

Також дослідниками було отримано зображення вірусу за допомогою скануючого (Scanning electron microscope, рис.2c) і просвічує (Transmission electron microscopy, рис. 2d) електронних мікроскопів. Порівнюючи дані зображення, можна, за твердженням авторів, побачити, що рентгенівський знімок вірусу (рис. 2b) володіє найбільшою контрастністю. Для кращої візуалізації отриманого рентгенівського зображення дослідники розфарбували знімок у відповідності зі значеннями електронної щільності усередині вірусу (рис. 4а). Зображення 4b за допомогою атомно-силового мікроскопа (див. Також Atomic force microscope) наведено для уточнення товщини вірусу.

Мал. 4. a – візуалізація в кольорі розподілу електронної щільності усередині вірусу – свого роду кольорова рентгенівська "фотографія" вірусу. b – зображення вірусу під атомно-силовим мікроскопом. Мал. з обговорюваної статті arXiv: 0806.2875

Мал. 5 показує розподіл електронної щільності уздовж пунктирної лінії, зображеної на рис. 4a.

Мал. 5. Розподіл електронної щільності уздовж пунктирної лінії, показаної на рис. 4a. Мал. з обговорюваної статті arXiv: 0806.2875

У висновку дослідники говорять про те, що досягнуте ними дозвіл 22 нм в отриманні рентгенівського зображення вірусу не є межею і, швидше за все, може бути покращено за допомогою проекту X-FEL – джерела когерентного рентгенівського випромінювання (рентгенівського лазера) на вільних електронах,що дозволить в подальшому зайнятися отриманням більш детальних знімків макромолекул, зокрема білкових комплексів.

джерело: Changyong Song, Huaidong Jiang, Adrian Mancuso, Bagrat Amirbekian, Li Peng, Ren Sun, Sanket S Shah, Z. Hong Zhou, Tetsuya Ishikawa, Jianwei Miao. Quantitative Imaging of Single, Unstained Viruses with Coherent X-rays // arXiv: 0806.2875 (17 June 2008).

Юрій Ерін


Like this post? Please share to your friends:
Залишити відповідь

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: