Прокаріотична система імунітету допоможе редагувати геном • Віра Башмакова • Новини науки на "Елементи" • Генетика, Мікробіологія

Прокаріотична система імунітету допоможе редагувати геном

Мал. 1. Дозрівання crРНК в CRISPR-системі I типу. CRISPR-ділянка складається з однакових послідовностей довжиною приблизно 30 нуклеотидів (повторів), Розділених різними послідовностями довжиною теж приблизно 30 нуклеотидів (спейсерами). CRISPR-ділянки зібрані в групи (касети); кількість CRISPR в касеті і кількість касет дуже різниться у різних видів бактерій і архей: у архей в одній касеті може бути аж 300-500 CRISPR. Повтори відрізняються у різних видів прокаріотів; що стосується спейсеров, то їх набір взагалі унікальний для кожного штаму. CRISPR-касети є сусідами з так званими Cas-генами, Що вносять серйозний внесок в роботу CRISPR-системи (докладніше про це розповідається в підписі до рис. 2). Після транскрипції CRISPR-касети один з Cas-білків, ендонуклеаза CasE, розрізає вийшов довгий незрілий РНК-попередник на короткі зрілі crРНК; у одержані crРНК фланкирующие (крайні) ділянки однакові і відбуваються з повторів, а середина унікальна і утворена спейсером. Зображення зі слайдів до лекції К. В. Северинова на Зимовій школі, зі змінами

Хоча прокаріоти – це одні з найбільш просто організованих істот на Землі (простіше влаштовані тільки віруси), їх пристрій вражає своєю витонченістю і досконалістю.Наприклад, недавно в науковому світі буквально вчинила переворот відкриття прокариотических CRISPR-систем, які забезпечують набутий імунітет до вірусів і плазмід. Про роботу цих систем і про те, що їх вивчення може дати людству, розповів у своїй лекції на що проходить за підтримки РВК, Фонду "Династія" і РФФД Зимовій школі FutureBiotech доктор біологічних наук Костянтин Вікторович Северинов.

Загадкові ділянки геному

В кінці 1980-х років в ході перших спроб секвенування генома кишкової палички японські дослідники виявили щось дивне – ділянки ДНК, що містять множинні ідентичні повтори, розділені неідентичних, унікальними ділянками – спейсерами (рис. 1, 2). Подібні ділянки стали виявляти і в інших прокаріотів. Після низки проміжних імен їх врешті-решт назвали CRISPR – Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, згруповані регуляторні розділені проміжками короткі паліндромний повтори. Вони є приблизно у 40% бактерій і майже у всіх архей.

Мал. 2. Дозрівання crРНК в CRISPR-системі II типу. Довгий незрілий попередник (пре-crРНК) Складається з чергуються повторів (показані чорним) І спейсеров (показані зеленим). Окремо синтезируемая Некодуючі РНК (tracrРНК) Комплементарна ділянці повтору. До повторам вона і приєднується, що призводить до розрізання області повтору за допомогою РНКази III в присутності білка Csn1. Це перший етап процесингу. На наступному етапі не до кінця з'ясованих поки чином від одержані обрізків відрізаються ще шматочки, в результаті чого і виходить повністю дозріла crРНК. Зображення зі статті Elitza Deltcheva et al., 2011. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III

Функція CRISPR довгий час залишалася неясною. Однак практична користь від CRISPR була отримана і без розуміння їх ролі: оскільки набір спейсеров унікальний для кожного штаму, то з їх допомогою можна ідентифікувати штами; на цьому, наприклад, заснований метод споліготіпірованія мікобактерій туберкульозу, широко застосовуваний в епідеміології для ідентифікації джерела збудника і визначення вогнища інфекції.

Але для чого потрібні ці загадкові CRISPR самим клітинам? Те, що вони так широко поширені в прокариотический світі, означало, що вони роблять щось дуже важливе, що необхідно майже всім прокариотам. Але що? Цього ніхто не знав.

Розгадка могла таїтися в нуклеотидної послідовності CRISPR, і особливо в послідовності унікальних, не повторюються ділянок – спейсеров.На жаль, до певного часу дослідження цих коротких нуклеотидних послідовностей не давали ніяких результатів. Здавалося, що спейсери кодують якусь абракадабру, яка нічому не відповідає, нічого не визначає і ні для чого не потрібна.

І ось близько десяти років тому виявилася одна цікава і дивна річ. Виявилося, що послідовності спейсеров даного виду прокаріотів підозріло часто збігаються з послідовностями геномів вірусів, які вражають цей вид. Таке дивне збіг говорило про те, що CRISPR-система – це щось на зразок прокариотического набутого імунітету, який дозволяє запам'ятати ворога і впоратися з ним при повторному зараженні. Приємно відзначити, що важливу роль в розгадки функції CRISPR зіграв наш колишній співвітчизник Євген Кунин.

CRISPR-система: набутий імунітет прокаріотів

В даний час відомо кілька типів CRISPR-систем. Розглянемо спочатку роботу CRISPR системи, характерну для кишкової палички Esherichia сoli.

При транскрипції CRISPR-касети виходять короткі некодуючі РНК – crРНК, кожна з яких складається з спейсера, оточеного двома ділянками повтору (рис. 1).Якщо клітку заражає вірус, послідовність ДНК якого комплементарна послідовності спейсера однією з crРНК, то клітина зможе пережити інфекцію.

Спейсер crРНК за допомогою комплексу спеціальних Cas-білків, який називається Cascade, приєднується до комплементарному ділянці вірусної ДНК – протоспейсеру (для цього необхідно ще, щоб перед протоспейсером в чужорідної ДНК знаходилася коротенька нуклеотидних послідовність – PAM, protospacer associated motif). Після цього до утворився комплексу підпливає ще один cas-білок – Cas3, ендонуклеаза / ХЕЛІКАЗИ, яка вносить в ДНК вірусу двуцепочечной розрив (рис. 3, B). В результаті чужорідна ДНК виявляється пошкоджена, вірусна інфекція припиняється, а клітина "здобуває перемогу" і залишається в живих.

Мал. 3. Механізм роботи CRISPR-системи I і II типу. В системі I типу (внизу) В процес розрізання залучено велику кількість компонентів. crРНК зв'язується з великим допоміжним білковим комплексом під назвою Cascade, Який утворений деякими з cas-білків (гени білків, які складають цей комплекс, на рис. 1 показані жовтим). Виявивши комплементарную ДНК-послідовність (протоспейсер), CrРНК за допомогою Cascade приєднується до неї; це викликає активацію ферменту Cas3 (Кодує його ген на рис. 1 показаний помаранчевим), Який розрізає чужорідну ДНК і цим рятує клітину. В системі II типу (вгорі) Компонентів менше: комплекс tracrРНК-crРНК з'єднується з протоспейсерним ділянкою чужорідної ДНК, а фермент Cas9 розрізає обидві нитки цієї ДНК за допомогою своїх доменів HNH і RuvC. Відзначимо, що в обох випадках для того, щоб crРНК могла приєднатися до протоспейсеру, перед цим протоспейсером повинен знаходитися коротенький ділянку під назвою PAM (protospaser adjancent motif; на даному малюнку названий просто motif). Зображення з синопсиса Stan J. J. Brouns, 2012. A Swiss Army Knife of Immunity

Приблизно так само влаштована і робота CRISPR-системи іншого типу, характерною, наприклад, для бактерії Streptococcus thermophilus, Використовуваної для виробництва багатьох молочнокислих продуктів, однак компонентів в ній менше і влаштована вона простіше. Дозрівання crРНК забезпечується короткою некодирующей РНК (trans-activating crRNA або tracrРНК), комплементарної ділянці затримки, а широко поширеним клітинним ферментом РНКази III (див. Ribonuclease III), а також допоміжним білком Csn1 (рис. 2). Атака на чужорідну ДНК проводиться за допомогою тієї ж tracrРНК і ендонуклеази Cas9 (рис.3, А).

Прокаріотична CRISPR-система захисту від вірусів дуже схожа на еукаріотичну систему РНК-інтерференції, яка також бере участь в антивірусного захисту і використовує для цього приблизно той же прийом – приєднання до небажаної мРНК короткого комплементарного РНК-ділянки і подальше виключення цієї непотрібної мРНК тим чи іншим способом (наприклад, її можна просто розрізати на шматочки).

Часто crРНК примудряються зв'язатися навіть з не повністю комплементарної послідовністю ДНК вірусу, за умови що є відповідний PAM-ділянку та початок протоспейсера повністю комплементарно послідовності спейсера (рис. 4). Таким чином, один спейсер може одночасно забезпечувати захист проти кількох подібних вірусів. Це зручно і дозволяє заощадити місце в маленькому прокариотический геномі.

Мал. 4. Схема зв'язування crРНК з чужорідної ДНК. Для цього зв'язування досить, щоб комплементарних був тільки початкова ділянка протоспейсера (він називається seed) І щоб перед протоспейсером знаходився «правильний» PAM. Зображення зі статті Semenova et al., 2011. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence

Однак що ж робити,якщо клітина ніколи раніше не зустрічалася з цим вірусом і не має crРНК з який дізнається його спейсером? Невже вона приречена? Невже вірус в цьому випадку отримає перемогу?

Не зовсім так. Звичайно, бпроБільша частина "наївних" бактерій буде знищена вірусом. Однак деякі клітини примудрилися з ним впоратися – і ось яким чином (рис. 5): заражені вірусом бактеріальні клітини починають гарячково вирізати все попалися під руку (точніше – під фермент) ділянки ДНК і вставляти їх в CRISPR-касету в якості спейсеров (важливу роль в цьому процесі відіграють ще два Cas-білка – Cas1 і Cas2).

Мал. 5. Підсумкова схема роботи CRISPR-системи на прикладі інфекції бактерії E. coli фагом М13.
1. Все починається з того, що фаг нападає на недосвідчену, що не зустрічалося раніше з даними збудником бактерію і впорскує в неї свою ДНК. (На малюнку показаний тільки один нападник фаг і тільки одне колечко його ДНК, що виявилося в клітці, однак насправді нападників фагів і впорснути ними ДНК набагато більше.) У відповідь бактерія за допомогою Cas1 / Cas2-білків починає гарячково вирізать все-ліпші ділянки ДНК – як фагів, так і свої власні, хазяйські – і вставляти їх в якості спейсеров в CRISPR.Якщо бактерії пощастило і вона вирізала правильний шматочок з фагової ДНК, то …
2. Інфекція викличе реакцію відповідної crРНК, Cascade-комплексу і Cas3 (детально показану на рис. 2 і 3), в результаті чого фагів ДНК буде знищена. Однак фаги теж не ликом шиті, вони теж хочуть виграти цю війну. Варто фагу мутувати (мутація показана червоною крапкою), Як crРНК перестане їх розпізнавати, і вони невидимими проникнуть в клітку і почнуть робити свої чорні справи. Здавалося б, клітина приречена, але …
3. Навіть недостатньо комплементарний шматочок фаговой ДНК активує CRISPR-систему, причому вирізання ДНК-фрагментів буде проводитися вже саме з фагової ДНК. Судячи з усього, забезпечується це тим, що Cas1 / Cas2-комплекс навіть при некрепком, недостатньо комплементарном приєднання crРНК до ДНК фага починає ковзати по цій ворожої ДНК, вирізаючи з неї один шматочок за іншим, поки не попадеться ділянку, відповідний на роль «правильного »спейсера. Цей спейсер і врятує клітину від зараження.
Зображення зі статті Kirill A. Datsenko et al., 2012. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR / Cas adaptive bacterial immunity system

БпроБільша частина вставлених ділянок виявиться марною або навіть шкідливою (наприклад,вставка в якості "портрета ворога" ділянки бактеріальної ДНК призведе до загибелі клітини за рахунок розкусили власної ДНК); проте деякі "щасливчики" випадково вставляють в якості CRISPR-спейсера фрагмент вірусної ДНК, що дає можливість синтезувати захисну crРНК і перемогти вірус. Цей новий спейсер вони передадуть всім своїм нащадкам, і тому від даного вірусу їхні нащадки будуть захищені. Взагалі, набір спейсеров в даній клітині – це, в якомусь сенсі, її історія, пам'ять про колишніх, виграних, боях з вірусами.

Але це ще не все. Виявляється, вставка спейсеров відбувається за принципом позитивного зворотного зв'язку, тобто вставка одного спейсера різко стимулює вставку наступних спейсеров з ДНК донора. Так, експерименти, проведені в лабораторії К. В. Северинова, показали, що якщо у даній бактерії є спейсер до даного вірусу, повторне зараження цим вірусом викликає спрямовану вставку додаткових спейсеров з ДНК вірусу. Іншими словами, якщо бактерія вже атакували раніше вірусами, то такі атаки вона перенесе легше, тому що у неї буде здатність ідентифікувати чужорідну ДНК і вставляти нові спейсери. Чимось схоже на вакцинацію, правда?

Практичне застосування

Яку ж практичну користь можна отримати з знань про роботу CRISPR-системи? Величезну, і в безлічі областей.

Почнемо з того, що прокариотические клітини активно використовуються людьми для самих різних речей – візьмемо хоча б усім відомі кисломолочні бактерії. Зрозуміло, що одна з найжахливіших речей, яка може трапитися при виробництві кисломолочних продуктів, – це атака бактеріофагів, що знищують бактеріальну культуру. Однак якщо ми знаємо, як захистити бактерії від цієї атаки, то проблем з виробництвом кисломолочних продуктів не буде.

У той же час, інші бактерії, навпаки, можуть завдати людині, тваринам або рослинам серйозної шкоди. Однак якщо ми знаємо, як вони захищаються від атак бактеріофагів, то можемо перешкодити їм це робити – і так врятуватися від бактеріальної інфекції.

Нарешті, є ще третя, на рідкість перспективне, застосування CRISPR-системи. З її допомогою можна з небаченою досі акуратністю редагувати геноми вищих організмів, включаючи людину. Про це нещодавно вийшли дві статті в Science (Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR / Cas Systems; Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9), і на цьому я зупинюся детальніше.

Найточніший ножиці для генома

Для того щоб "відредагувати" якесь місце в ДНК, наприклад виправити мутацію, що приводить до генетичного захворювання, треба спочатку це місце разрезать. При цьому розрізає фермент – ендонуклеаза – повинен володіти високою специфічністю, тобто різати ДНК в потрібному місці і тільки в ньому (бо розрізання ДНК в непотрібному місці може призвести до абсолютно непотрібним наслідків). А значить, ділянка ДНК, за яким розпізнається це потрібне місце, повинен бути якомога довше – адже чим він довший, тим менше ймовірність, що таку ж ділянку зустрінеться десь ще на просторах генома і що там теж пройдуться "ножиці" ендонуклеази.

І ось так як захисний комплекс CRISPR-систем зв'язується з відносно довгими (не менш 20 нуклеотидів) ділянками ДНК, відповідними спейсерами, то виникає можливість досягти високої специфічності редагування.

За основу своєї розробки обидві групи авторів опублікованих в Science статей взяли просто влаштовану систему з Streptococcus thermophilus, Що складається всього з чотирьох обов'язкових елементів – tracrРНК, crРНК, РНКази III і Cas9 (рис. 3, А). Чим менше компонентів, тим простіше працювати з системою і тим вище шанс, що система запрацює в нестандартних для себе умовах роботи в еукаріотичної клітці.Дослідникам вдалося забезпечити високий ступінь спрощення систему. По-перше, вони створили "химерну" tracr-crРНК, яка працювала нітрохи не гірше, ніж tracrРНК і crРНК, синтезовані окремо (рис. 6). По-друге, вони виявили, що бактеріальна РНКаза III для роботи системи не обов'язкова, оскільки її функцію можуть виконують "місцеві" РНКази, синтезовані в еукаріотичної клітці.

Мал. 6. «Химерного» РНК має всі ключові фрагменти crРНК і tracrРНК, необхідні для правильного функціонування в клітці: направляючу послідовність (найбільш значимий ділянку спейсера, що зв'язується з ДНК) і ділянку повтору, пов'язаний зі шматочком tracrРНК. Така «химера» набагато простіше за структурою, ніж дві окремі молекули crРНК і tracrРНК, а працює приблизно з тією ж ефективністю. Зображення зі статті Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR / Cas Systems. Подібну структуру отримали і дослідники з другої групи (Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9)

Таким чином, для того щоб разрезать в клітці ДНК в потрібному місці, потрібно було зробити зовсім небагато:

1) Поставити послідовність, комплементарную цього "потрібного місця", як спейсера в CRISPR-касету і отримати химерну tracr-crРНК.

2) Запустити експресію цієїCRISPR-касети і білка Cas9 у відповідній клітці, додавши до них сигналом ядерної локалізації (NLS), щоб вони не "тинялися без толку" по цитоплазмі, а пливли прямо в ядро, де, власне, і знаходиться Розбита ДНК.

Отримана система в роботі на клітинних культурах показала відмінні результати: з її допомогою можна як видаляти з ДНК якісь ділянки, так і вставляти туди нові області. CRISPR-система показала кращу ефективність, ніж попередні "фаворити" в цій області – цінковопальцевие нуклеази (див. Zinc finger nuclease) і TALEN. Не можна, звичайно, говорити про те, що CRISPR-система дозволить робити з геномом все, що тільки заманеться досліднику, але, мабуть, з усіх існуючих методик вона найбільш близька до цього.

джерела:
1) Лекція К. В. Северинова на Зимовій школі FutureBiotech.
2) Le Cong, F. Ann Ran, David Cox et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR / Cas Systems // Science. V. 339. P. 819-823.
3) Prashant Mali, Luhan Yang, Kevin M. Esvelt. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 // Science. V. 339. P. 823-826.
4) John van der Oost. New Tool for Genome Surgery // Science. V. 339. P. 768-770 (синопсис до двох вищевказаних статей).
5) Kirill A. Datsenko, Ksenia Pougach, Anton Tikhonov et al. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR / Cas adaptive bacterial immunity system // Nature Communications. V. 3. Article number: 945. Published 10 July 2012.
6) Ksenia Pougach, Ekaterina Semenova, Ekaterina Bogdanova et al. Transcription, Processing, and Function of CRISPR Cassettes in Escherichia coli // Mol Microbiol. V. 77. P. 1367-1379.

Віра Башмакова


Like this post? Please share to your friends:
Залишити відповідь

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: