Проект "Розетта" допоможе підібрати блокатори агрегації для білків • Віра Башмакова • Новини науки на "Елементи" • Молекулярна біологія, Медицина

Проект “Розетта” допоможе підібрати блокатори агрегації для білків

Мал. 1. Схема, за якою дослідники підбирали відповідний блокатор агрегації для білка тау. За тією ж схемою підбирався блокатор і для 248PAP286. Спочатку в білку ідентифікується ділянку – половинка застібки-блискавки, який схильний до агрегації (identify steric-zipper segment). Потім перевіряється, чи справді ця ділянка здатний утворювати фібрили і мікрокристали (confirm segment forms fibrils and microcristals). Після цього визначається атомна структура цієї ділянки (determine atomic structure) і під цю структуру підбирається інгібітор (design ingibitor), який би "застібав" цю блискавку. І наостанок, in vitro підтверджується, що в присутності інгібітора білок не утворює фібрил (Test ingibitor in vitro). Зображення з обговорюваної статті в Nature

Якщо білок неправильно склався, не набув вірну конформацию (див. Згортання білків), він може почати злипатися з собі подібними, невірно складеними білками, що призводить до утворення білкових агрегатів. Такі агрегати характерні для багатьох хвороб (в основному нейродегенеративних, см. Neurodegeneration). Поки що не можна з певністю сказати, гублять вони клітини, в яких знаходяться, або, навпаки, рятують від неминучої загибелі (див. Нейрофібрилярних клубки при хворобі Альцгеймера – не вбивця, а захисники клітин ?, "Елементи", 15.05.2010).Однак зв'язок між хворобою і виникненням білкових агрегатів безсумнівно існує, і тому ці агрегати зараз бурхливо вивчаються. У тому числі проводяться спроби за допомогою різних хитрощів зупинити білкову агрегацію. Один із способів це зробити описано в статті, опублікованій в журналі Nature.

Є кілька моделей, що пояснюють, як саме відбувається агрегація білка. Одна з них передбачає, що в деяких білках є певні ділянки (мають β-конформацію), які володіють тривимірною структурою, що нагадує шматок пазла з виїмками або половинку застібки-блискавки. Ці ділянки "застібаються" з аналогічними ділянками на інший білкової молекулі, і з цієї причини і починає рости фібрила.

З цього випливають два висновки. По-перше, в освіті агрегатів винен не весь білок цілком, а тільки короткі його фрагменти. А по-друге, якщо підібрати якусь речовину, яке буде володіти "застежкоподобной" просторовою структурою, що ідеально підходить під структуру таких підступних фрагментів, то воно зможе закрити собою ці фрагменти, запобігти їх злипання і таким чином зупинити агрегацію.

Підбором такого речовини і зайнялася група вчених під керівництвом Девіда Ейзенберг (David_Eisenberg), відомого американського біохіміка, який зіграв важливу роль у розвитку комп'ютерних методів молекулярної біології.

У фокусі уваги вчених виявилися два коротких "застежкоподобних" ділянки з двох схильних до агрегування білків.

Перший з них – це шестіамінокіслотний пептид VQIVYK (великі латинські літери – це імена амінокислот), фрагмент білка тау, внутрішньоклітинні агрегати якого спостерігаються при хворобі Альцгеймера. Показано, що цей фрагмент має велике значення для виникнення тау-агрегатів, а крім того, сам по собі може утворювати фібрили, подібні за своїми властивостями з фибриллами цілого білка.

А другий, теж шестіамінокіслотний, пептид GGVLVN – фрагмент простатичної кислої фосфатази, або РАР (див. Prostatic acid phosphatase) – білка, який у великих кількостях зустрічається в насінної рідини. Показано, що фібрили, утворені його ділянкою 248PAP286, Сильно підвищують ризик зараження СНІДом. Досліджуваний в даній роботі пептид GGVLVN був фрагментом саме 248PAP286.

Щоб підібрати відповідний інгібітор досліджуваних пептидів, дослідники використовували спеціальне програмне забезпечення під назвою Rosetta ( "Розетта"),яке дозволяє змоделювати просторову конфігурацію білка на основі його амінокислотної послідовності і навпаки – підібрати амінокислотну послідовність, яка буде утворювати необхідну просторову конфігурацію.

В результаті дослідникам вдалося підібрати штучний пептид D-TLKIVW (де D позначає, що всі амінокислоти в цьому пептиді знаходяться в D-конфігурації, тобто є оптичними ізомерами, дзеркальними відображеннями звичних L-амінокислот). Цей пептид за своєю просторової конфігурації ідеально підходив до VQIVYK, "пристібався" до нього і не дозволяв "пристебнутися" наступним верствам VQIVYK, таким чином зупиняючи освіту фібрил. У дослідах in vitro було показано, що агрегація припиняється не тільки у самого VQIVYK, а й у більш довгих фрагментів білка тау, що містять VQIVYK.

Мал. 2. При додаванні пептиду D-TLKIVW до розчину К12 (це фрагмент білка тау, що містить VQIVYK-послідовність) агрегація не почалась навіть в присутності затравки (seed), коричнева лінія. Без D-TLKIVW або з пептидом, у якого амінокислоти розставлені не в тому порядку (D-TIWKVL), агрегація починається дуже швидко (чорна і зелена лінії). По горизонтальній осі – час в годинах. За вертикальної осі – рівень агрегації, виміряний по флуоресценції тіофлавіном S (див. Thioflavin), флуоресцентної фарби, яка специфічно зв'язується з фибриллами. Зображення з обговорюваної статті в Nature

Щоб зрозуміти, як саме працює отриманий пептид, дослідники "прогнали" його по серії тестів. Вони міняли місцями його амінокислотні залишки, замінювали D- на L- амінокислоти, і перевіряли, чи працює він з іншими білками, які не містять послідовності VQIVYK. В результаті з'ясувалося, що D-TLKIVW працює краще, ніж L-TLKIVW; що перепутиваніе амінокислот в пептиді призводить до втрати його властивостей; і нарешті, що цей пептид згоден зв'язуватися тільки з VQIVYK-послідовністю і ніяк не впливає на агрегацію білків, які її не містять (це остання властивість пептиду дуже радує, так як говорить про те, що він не буде порушувати агрегацію білків, які в нормі і повинні утворювати фібрили).

При цьому, що особливо важливо, було виявлено, що D-TLKIVW пов'язується саме зі строгоструктурірованнимі VQIVYK-фибриллами, а не з розчинними у воді мономерами VQIVYK-пептиду, які мають не таку жорстку просторову конфігурацію. Іншими словами,пептид працює саме тому, що він специфічно, дуже точно підходить до агрегатогенному ділянці білка, що і було передбачено за допомогою комп'ютерного моделювання його структури.

Аналогічним чином вчені підібрали і другий пептид – інгібітор агрегації для GGVLVN, фрагмента простатичної кислої фосфатази. Цей пептид, Trp-His-Lys-chAla-Trp-hydroxyTic, був названий дослідниками WW61. До його складу, крім "класичних", пептідогенних, амінокислот, входили і "нестандартні", які не зустрічаються в білках, – chAla (похідне аланина) і hydroxyTic (гігантське похідне проліну і тирозину).

WW61 теж відмінно запобігає утворенню агрегатів in vitro, Причому не тільки у короткого пептиду GGVLVN, до якого він "підігнаний", але і у більш довгого ділянки білка, 248PAP286, До складу якого і входить GGVLVN.

Оскільки фібрили, утворені ділянкою 248PAP286 в спермі, збільшують ризик ВІЛ-інфекції, вчені вирішили перевірити, чи не зможе WW61 зменшити цей ризик. Для цього вони обробили ВІЛ-частинки розчином 248PAP286, Який перед цим був витриманий протягом 20 годин (щоб почалося утворення фібрил) в присутності або за відсутності WW61, а потім спробували заразити ними культуру клітин. Результати були просто феєричними – WW61 практично запобігав зараження.

Мал. 3. Пригнічення утворення фібрил запобігає зараженню ВІЛ в культурі клітин. По горизонтальній осі – концентрація 248PAP286 в микрограммах на мілілітр, по вертикальній – ступінь зараження клітин, виміряна за рівнем активності β-галактозидази (див. Beta-galactosidase; цей фермент ставлять під контроль вірусного промотора – таким чином за активністю β-галактозидази можна зрозуміти, заразилися клітини чи ні). Видно, що в присутності інгібітора зараження практично не настає. Зображення з обговорюваної статті в Nature

У цій роботі прекрасні не стільки отримані прикладні результати (наприклад, велике питання, чи варто взагалі зупиняти агрегацію тау і не принесе це більше шкоди, ніж користі), скільки сам підхід до проблеми. Розроблена методика дозволяє підібрати блокатори агрегації для безлічі білків. А крім того, дана робота є вагомим аргументом на користь того, що "застежкоподобние" ділянки відіграють важливу роль в утворенні фібрил.

джерело: Stuart A. Sievers, John Karanicolas, Howard W. Chang, Anni Zhao, Lin Jiang, Onofrio Zirafi, Jason T. Stevens, Jan Münch, David Baker, David Eisenberg. Structure-based design of non-natural amino-acid inhibitors of amyloid fibril formation. // Nature. 2011. V. 475. P. 96-100.

Віра Башмакова


Like this post? Please share to your friends:
Залишити відповідь

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: