Мутує людство: що ми дізналися про своїх мутаціях за 15 років геномної ери • Олександр Марков • Новини науки на "Елементи" • Генетика, Медицина, Еволюція

Мутує людство: що ми дізналися про своїх мутаціях за 15 років геномної ери

Мал. 1. Швидкість мутагенезу у різних організмів. За вертикальної осі – темп нуклеотидних замін (на мільярд пар основ за покоління), по горизонтальній – розмір генома (в мільйонах пар основ). лівий графік – віруси і прокаріоти, правий – еукаріоти (на правом графіку також показані усереднені значення для бактерій і архей). Червона лінія відповідає рівню мутагенезу, рівному однієї мутації на геном за покоління. Видно, що у вірусів і прокаріотів чим більше геном, тим нижче темп мутагенезу, тоді як у еукаріот спостерігається зворотна залежність. Видно також, що ссавці характеризуються екстремально високим числом мутацій на геном за покоління. Eubacteria – бактерії, Archaea – археї, Double-stranded DNA viruses, Single-stranded DNA viruses – віруси, що містять дво- і однонитевую ДНК, RNA viruses – РНК-віруси, Mammals – ссавці, Invertebrates – безхребетні, Plant – рослина, Unicellular eukaryotes – одноклітинні еукаріоти. Зображення зі статті: Lynch M., 2010. Evolution of the mutation rate // Trends in Genetics. V. 26. P. 345-352 (зі змінами)

За 15 років, що минули з часу першого чорнового прочитання людського генома, наші знання про мутації, раз у раз виникають в наших генах, багаторазово збільшилися, а методи їх вивчення стали набагато ефективніше і різноманітніше. В оглядовій статті американських генетиків, опублікованій в журналі Science, Підводяться підсумки вивчення мутаційного процесу у Homo sapiens за перші півтора десятиліття "геномної ери".

Мутагенезу – одне з найбільш фундаментальних біологічних явищ. Всі без винятку живі істоти схильні до мутацій. Випадкові зміни в послідовності нуклеотидів ДНК виникають як під час реплікації (розмноження) молекул ДНК, так і в проміжках між актами реплікації (наприклад, під дією ультрафіолетового випромінювання та інших мутагенів). Більшість мутацій відразу виправляється спеціальними системами лагодження (репарації) ДНК, але навіть найскладніші і досконалі системи репарації не забезпечують стовідсотковий захист.

Темп мутагенезу сильно різниться у різних організмів, однак у жодного істоти – від вірусів до людини – він не дорівнює нулю. Цей факт може здатися тривіальним, але насправді він вимагає пояснень, і ось чому.

Як правило, серед ненейтральні (впливають на пристосованість) мутацій набагато більше шкідливих, ніж корисних. Так виходить по чисто імовірнісним причин (див. Принцип Анни Кареніної). Отже, чим нижче темп мутагенезу, тим вище, при інших рівних, буде середня пристосованість нащадків даного організму.Тому відбір, здавалося б, завжди повинен сприяти зниженню темпів мутагенезу: під його дією повинні розвиватися все більш точні системи реплікації і репарації. Чому ж ці системи так і не стали абсолютно безпомилковими?

Причин, швидше за все, дві. Першу можна умовно назвати "економічної". Надточні системи реплікації і репарації, швидше за все, були б занадто дорогі: громіздкі, енергоємні, їх робота сповільнювала б реплікацію або мала якісь інші шкідливі побічні ефекти. До того ж чим точніше працюють ці системи, тим слабкіше тиск відбору, спрямованого на їх подальше удосконалення.

Друга причина полягає, звичайно ж, в тому, що корисні мутації теж ні-ні, та й відбуваються (див .: Ранні етапи адаптації передбачувані, пізні – випадкові, "Елементи", 03.03.2015). Тому, хоча середня пристосованість нащадків мутують організмів завжди буде нижче, ніж у немутірующіх, розкид пристосованості і максимальна пристосованість у перших будуть вище. Тому в багатьох ситуаціях, особливо при змінах середовища, явна перевага буде на боці мутують організмів не тільки в довгостроковій перспективі (тисячі і мільйони років), а й в короткостроковій (в масштабі одного або декількох поколінь).Для деяких організмів прямої шкоди занадто повільного мутації вдалося показати експериментально (див .: Віруси-мутанти допомагають один одному в боротьбі за виживання, "Елементи", 14.12.2005).

Так чи інакше, мутації неминучі, шкідливих серед них набагато більше, ніж корисних, і всьому живому доводиться з цим миритися (і, більш того, до цього пристосовуватися). Ми, люди, не тільки не є винятком, але навіть, разом з іншими ссавцями, сильно випереджаємо більшість живих істот за темпами мутагенезу в розрахунку на особину за покоління (рис. 1).

геном Homo sapiens вперше був начорно прочитаний близько 15 років тому (див. Проект "Геном людини"). З цього моменту почалася нова ера у вивченні мутаційного процесу у нашого виду. Завдяки стрімкому розвитку технологій секвенування і аналізу геномних послідовностей сьогодні ми знаємо набагато більше, ніж на початку XXI століття, про темп мутацій, про закономірності їх розподілу по геному, про їх роль в різних патологіях (включаючи рак) і про інші особливості нашого мутагенезу, що мають як теоретичне, так і практичне значення.

У свіжому випуску журналу Science опублікована добірка статей, присвячених цієї досить актуальної теми.Більшість з них стосуються вузькоспеціальних, в тому числі медичних питань, але в одній, написаної генетиками з Вашингтонського університету в Сієтлі, даний загальний огляд того, що ми дізналися про своїх мутаціях за останні 10-15 років.

1. Темп мутацій "зародкової лінії". Всі мутації можна поділити на соматичні (що відбуваються в соматичних, тобто не статевих клітинах організму на різних стадіях розвитку) і мутації "зародкової лінії" (germline mutations), що змінюють геном статевих клітин і передаються у спадок нащадкам. З медичної точки зору вкрай важливі обидва типи мутацій, з еволюційної – другі, звичайно, важливіше.

Перші оцінки швидкості виникнення мутацій в зародковій лінії у людини були зроблені задовго до геномної ери, однак їх точність була невелика. Сьогодні для цього використовують кілька підходів. Один з них – вивчення родоводів з метою підрахунку знову виникаючих мутацій з чітким фенотипическим ефектом і високою пенетрантностью (тобто таких мутацій, які змінюють фенотип, по-перше, строго певним чином, по-друге – напевно). Як правило, для цього використовують мутації, що викликають вроджені патології – "Менделя" (спадщини відповідно до законів Менделя) спадкові хвороби.Вони успадковуються за Менделем, тому що викликаються одиничними мутаціями, а не хитрими комбінаціями десятків і сотень "алелей ризику" в поєднанні з факторами середовища. В одному з недавніх досліджень, заснованих на цьому підході, темп однонуклеотидних замін у людей був оцінений в 1,28 мутацій на 100 млн пар основ за покоління (1,28 × 10-8 на нуклеотид за покоління) (M. Lynch, 2010. Rate, molecular spectrum, and consequences of human mutation). Оскільки в диплоидном геномі людини приблизно 6 млрд пар основ, це відповідає 77 новим мутацій на геном за покоління.

Інший підхід заснований на порівнянні геномів людини і інших приматів. Підрахувавши відмінності в нейтральних (які не перебувають під дією відбору) ділянках генома, можна зіставити отриманий результат з часом життя останнього загального предка порівнюваних видів (наскільки його можна оцінити по палеонтологічними даними). Згідно нейтральної теорії молекулярної еволюції, швидкість накопичення нейтральних генетичних відмінностей між видами в ідеалі повинна бути просто-напросто дорівнює швидкості нейтрального мутагенезу (за одне покоління між двома видами накопичується стільки ж відмінностей, скільки нових мутацій виникає у кожної особини).Тому, знаючи час дивергенції, темп мутагенезу можна розрахувати за формулою m = D/2t, де D – число нейтральних відмінностей між видами, t – час життя останнього загального предка в "поколіннях назад". Двійка у формулі з'являється через те, що обидва види після розбіжності накопичували мутації незалежно один від одного.

Втім, існує купа факторів, що порушують правильний хід "молекулярних годин", та й палеонтологічні датування останніх загальних предків, м'яко кажучи, не завжди точні. Тому надійність даного методу невисока. Не дивно, що результати він дав дещо інші. Наприклад, після прочитання генома шимпанзе темп нашого мутагенезу був оцінений в 2,2 × 10-8 замін на нуклеотид за покоління, або 132 нових мутації у кожного новонародженого – майже вдвічі більше, ніж показав аналіз спадкових хвороб (The Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium, 2005. Initial sequence of the chimpanzee genome and comparison with the human genome).

В останні роки завдяки різкого здешевлення повногеномне аналізу з'явилася можливість оцінювати темп мутагенезу безпосередньо, просто порівнюючи геноми батьків з геномами їхніх дітей і підраховуючи нові мутації. З'явилися і інші підходи, зокрема засновані на палеогенетіческіх даних.Наприклад, прочитання геномів неандертальців та інших стародавніх людей дозволило оцінювати темп мутагенезу за кількістю "відсутніх мутацій" в цих геномах, тобто по тому, наскільки менше генетичних відмінностей від загального предка встигла накопичити лінія, вимерла десятки тисяч років тому, в порівнянні з нами сьогоднішніми . Ці та інші нові методи дають оцінки в діапазоні від 1,0 × 10-8 до 1,2 × 10-8 замін на нуклеотид за покоління, тобто 60-72 нових мутацій у кожного новонародженого. І це, мабуть, близько до істини.

Звичайно, це середні значення: у окремих індивідів число нових мутацій може бути як менше, так і істотно більше середнього. У будь-якому випадку сумніватися не доводиться: ми всі – закоренілі мутанти! Далеко до нас будь-якої дрібниці на зразок бактерій або дріжджів, у яких одна-єдина нова мутація може припадати на тисячу, а то і на десять тисяч "новонароджених" (клітинних поділів) (рис. 1).

У ссавців "під відбором" знаходиться 5-10% геному, а все інше – в основному сміття (висловлюючись політкоректно, це області, всі або майже всі мутації в яких є нейтральними, тобто не впливають на пристосованість і не піддаються дії відбору) ( см .: Порівняння геномів 29 ссавців проливає світло на еволюцію людини, "Елементи", 05.11.2011).Отже, з 60-70 нових мутацій в геномі середньостатистичного новонародженого приблизно 3-7 є шкідливими. Темп виникнення корисних мутацій точно не відомий, але вони напевно досить рідкісні, щоб ними можна було знехтувати, говорячи про одного середньостатистичному людині.

Від трьох до семи нових шкідливих мутацій у кожної людини в кожному поколінні – це загрозливо багато. Потрібен сильний очищающий відбір, щоб уникнути виродження, тобто неухильного накопичення генетичного вантажу (див. Genetic load). Якщо ж на відбір надія погана, то залишається сподіватися тільки на високі біотехнології: генну інженерію, генну терапію, екстракорпоральне запліднення з штучним відбором ембріонів тощо (див .: Олексій Кондрашов, Надія Маркіна. Життя без відбору: благо чи небезпека?). Втім, про загрозу виродження в обговорюваній статті мова не йде (але ця проблема обговорюється в статтях, на які посилаються автори огляду).

Крім однонуклеотидних замін бувають ще вставки і випадання ( "Заксправ", див. Indel), інверсії (повороти на 180 °) і дуплікації фрагментів ДНК різної довжини. Такі мутації відбуваються рідше, ніж однонуклеотидні заміни, зате вони зачіпають більше число нуклеотидів та, звичайно, теж впливають на ймовірність розвитку будь-яких хвороб.За наявними оцінками, поки що не дуже точним, кожна людина несе в середньому близько трьох нових дрібних (1-20 пар основ) вставок і делецій і 0,16 більших (> 20 пар основ).

Знаючи темп мутагенезу, чисельність населення і народжуваність, можна приблизно оцінити загальний масштаб генетичного поліморфізму сучасного людства. Масштаб цей вражає: тільки за час життя одного останнього покоління в людській популяції мало заново з'явитися понад 1011 точкових мутацій – багато більше, ніж нуклеотидів в геномі! Мабуть, кожна можлива точкова мутація (крім несумісних з життям) мається на даний момент як мінімум у сотні-другої живуть на планеті людей. Зареєстрованих поліморфізмів, зрозуміло, набагато менше, адже до поголовного прочитання геномів справа ще не дійшла.

2. Закономірності розподілу мутацій по геному. Як відомо, мутації випадкові. По крайней мере, в першому наближенні. Це, втім, не означає, що ймовірність виникнення всіх мутацій абсолютно однакова або що процес мутагенезу повністю хаотичний у всіх своїх аспектах. Під "випадковістю" мутацій мається на увазі цілком конкретна річ, а саме відсутність прямого впливу корисності або шкідливості мутації на ймовірність її виникнення.У живих істот немає механізму, що дозволяє розрахувати, яка саме мутація буде їм корисна в даних умовах, і внести саме цю мутацію в свій геном. Правда, є механізми, що дозволяють трохи підвищити ймовірність появи корисних мутацій (приклад – соматичне гіпермутірованіе іммуноглобулінових генів у лімфоцитах, див .: Мутагенез в лімфоцитах – результат цілеспрямованої зміни ДНК і подальшої "неточною лагодження", "Елементи", 03.09.2007) і знизити ймовірність появи шкідливих. Зокрема, виявилося, що частота мутації у людей пов'язана з тимчасовою послідовністю реплікації хромосом (див. Replication timing). У ділянках, реплицирующихся раніше інших, виникає менше мутацій, ніж в ділянках, реплицирующихся в останню чергу. Це вигідно, оскільки першими, як правило, реплицируются ділянки, в яких багато генів. Відповідно, мутації в цих регіонах часто виявляються шкідливими. Останніми ж реплицируются ділянки ДНК, в яких переважає "сміття" і в яких тому більшість мутацій виявляються нейтральними.

Найсильніший "перекіс" в розподілі мутацій в людському геномі полягає в тому, що найчастіше мутують нуклеотиди Ц (цитозини), за якими слід нуклеотид Г (гуанін) (див. CpG site).Цитозин взагалі є "слабкою ланкою" в ДНК, оскільки він схильний перетворюватися в урацил (У) в результаті спонтанного деамінування. Однак системи репарації пильно стежать за тим, щоб ніяких урацілом в ДНК не було, і швидко виправляють більшість виникли таким способом мутацій.

Дінуклеотід ЦГ відрізняються тим, що входять до їх складу цитозини часто піддаються метилированию (див. Метилирование ДНК). Метильований цитозин в результаті деамінування перетворюється вже не в урацил, а в тимін – "законне" підстава, в нормі що входить до складу ДНК. Виявити таку мутацію системам репарації набагато важче.

В результаті частота мутації цитозин в дінуклеотід ЦГ приблизно в 10 разів вище норми. Це, в свою чергу, призводить до нерівної народження амінокислотних замін. З усіх 20 амінокислот в людських білках самим "вразливим" є аргінін. Як з'ясувалося, понад 16% всіх амінокислотних замін, що призводять до спадкових хвороб, – це заміни аргініну (рис. 2). Це факт, на перший погляд загадковий, пояснюється дуже просто. Якщо подивитися в таблицю генетичного коду, то можна переконатися, що всі 4 кодону, що починаються зі схильного до мутацій динуклеотид ЦГ, кодують саме аргінін.

Мал.2. Відносна частота амінокислотних замін у людини. Рекордсменом за кількістю замін є аргінін (R), тому що 4 з 6 кодують його триплетів починаються з динуклеотид ЦГ (дані засновані на аналізі 4000 несинонимичной мутацій, що викликають спадкові хвороби). Малюнок з обговорюваної статті в Science.

В кодують послідовностях динуклеотидів ЦГ більше, ніж в середньому по геному, що сприяє більш високого темпу мутації кодують послідовностей в порівнянні з некодуючими. Втім, є також механізм, що знижує частоту мутації кодують послідовностей, принаймні тих, які часто транскрибируются. Справа в тому, що транскрібіруемих послідовності піддаються більш якісної репарації (див. Transcription coupled repair). Через це в генах, активних в клітинах зародкової лінії, успадковані мутації виникають рідше, ніж в середньому по геному.

Очевидно, що патерн мутації, як і інші ознаки організму, цілком може еволюціонувати під дією мутацій, відбору і дрейфу. Він може трохи відрізнятися не тільки у людини і шимпанзе, але навіть у різних людських популяцій. І це не тільки теорія.Так, порівняно недавно, від 40 до 80 тисяч років тому, змінився патерн мутації у предків нинішніх європейців, які тоді якраз відділилися від предків азіатів. А саме, у європейців підвищився темп виникнення мутацій в трінуклеотідамі ТЦЦ. Ці трінуклеотідамі стали частіше перетворюватися в ТТЦ (5'-ТЦЦ-3 '→ 5'-ТТЦ-3 ') (K. Harris, 2015. Evidence for recent, population-specific evolution of the human mutation rate).

Відомо, що саме такі мутації найчастіше виникають в клітинах шкіри під дією ультрафіолету. Особливо характерні вони для клітин меланоми. У європейців шкіра в ході еволюції стала прозорішою для ультрафіолету, ніж у інших людських популяцій, тому почастішання подібних мутацій в клітинах шкіри легко пояснити. Але ось як ці мутації проникають в зародкову лінію, точно не відомо. Одна з гіпотетичних можливостей полягає в тому, що ультрафіолет підвищує частоту мутацій даного типу і в шкірі, і в статевих клітинах одним і тим же непрямим шляхом, сприяючи деградації фолієвої кислоти. Дефіцит цього вітаміну може призводити до збоїв в ході синтезу ДНК. Так чи інакше, цей факт наочно показує, що патерн мутації в людських популяціях дійсно схильний до еволюційних змін.

3.Немолоді батьки – головне джерело спадкових мутацій. На сьогоднішній день твердо встановлено, що левову частку нових спадкових мутацій люди отримують від батьків. При цьому чим старше чоловік, тим більше мутацій в його сперматозоїдах (про причини цього розказано в новини У шимпанзе, як і у людей, число мутацій у потомства залежить від віку батька, "Елементи", 18.06.2014). Близько 95% варіабельності нащадків за кількістю нових мутацій пояснюється віком батька. Гірше того, виявилося, що у старих батьків згладжується згадана вище залежність частоти мутацій від послідовності реплікації (replication timing). Відповідно, зростає частка мутацій в "осмислених" ділянках генома, а серед таких мутацій вище частка шкідливих.

З віком матері число мутацій в її яйцеклітинах не збільшується, зате ймовірність народження дітей з хромосомними порушеннями, такими як синдром Дауна, зростає.

Коротше кажучи, заводити дітей все-таки краще в молодості. Спостерігається в розвинених країнах тенденція до збільшення середнього віку батьківства і материнства додатково посилює ризик генетичного виродження людства.

4. Соматичні мутації і їх медичне значення. За життя людини клітини його тіла діляться трильйони разів.Кожне ділення пов'язане з ризиком соматичних мутацій, та й в проміжках між реплікаціями молекули ДНК можуть пошкоджуватися. У тканинах, клітини яких діляться особливо інтенсивно (наприклад, в кишковому епітелії), до 60 років має бути присутня, хоча б в одній клітці, чи не кожна з усіх можливих точкових мутацій. Різноманітність соматичних мутацій вище, ніж спадкових, тому що першим, щоб не бути негайно відбракованими відбором, досить бути сумісними з життям всього-на-всього однієї клітини, тоді як другим необхідна сумісність з життям цілого організму.

Хоча соматичні мутації не передаються у спадок, їх медичне значення дуже велике. Давно відомо, що вони грають ключову роль в розвитку різних видів раку (див .: На шляху до детального каталогу ракових генів, "Елементи", 06.04.2015). В останні роки стало ясно, що соматичні мутації викликають і багато інших захворювань (R. P. Erickson, 2010. Somatic gene mutation and human disease other than cancer: An update). Наприклад, з'ясувалося, що соматичні мутації в генах PIK3CA, AKT3 і mTOR викликають гемімегаленцефалію – одностороннє збільшення і порушення функції одного з півкуль мозку, яке до того ж підвищує ризик розвитку епілепсії.Порівняно невелика частка мутантних клітин може порушити роботу великих областей кори: у пацієнтів з дисфункцією цілого півкулі мутацію можуть нести лише від 8 до 35% клітин мозку. Мабуть, соматичні мутації лежать в основі багатьох інших патологій центральної нервової системи (A. Poduri et al., 2013. Somatic Mutation, Genomic Variation, and Neurological Disease).

5. На шляху до розуміння фенотипических ефектів мутацій. Кінцевою – і навряд чи досяжною в доступному для огляду майбутньому – метою вивчення людських мутацій є створення їх повного каталогу із зазначенням впливу кожної мутації на фенотип. В ідеалі добре б ще розібратися у взаємному впливі ефектів різних мутацій один на одного (див. Epistasis), але до повного каталогу таких взаємодій поки ще занадто далеко.

Ефекти мутацій вивчають на трьох рівнях, які можна умовно назвати молекулярною, медичним і еволюційним. У першому випадку мова йде про те, як та чи інша мутація впливає на експресію гена або функцію білка. У другому – про те, як мутація впливає на ймовірність розвитку тих чи інших захворювань. У третьому – про вплив мутацій на пристосованість (репродуктивний успіх). Звичайно, це взаємопов'язані речі, але кореляції між ними не суворі.Наприклад, мутації, що викликають старечі хвороби, навряд чи будуть "шкідливими" з еволюційної точки зору: вони не позначаться на репродуктивному успіху. Ослаблення функції якого-небудь ферменту може позначитися на здоров'ї людини в одних умовах середовища, але ніяк не проявитися в інших, і так далі. Всі три типи досліджень пов'язані з великими методологічними труднощами, тому поки ми маємо більш-менш детальну інформацію лише по відносно невеликій кількості мутацій.

Наприклад, з'ясування молекулярних ефектів мутацій – це надзвичайно кропітка робота, яку, однак, можна проводити в пробірці. У підсумку, витративши неймовірну кількість сил і засобів, можна отримати більш-менш повний мутационно-функціональний спектр для якогось білка. На рис. 3 показані результати дослідження впливу різних амінокислотних замін на убіквітин-лігазну функцію (див. Ubiquitin ligase) регуляторного білка BRCA1. Це білок, пришиваючи убіквітин до інших білків, регулює репарацію ДНК і відіграє важливу роль у захисті від раку.

Мал. 3. Малюнок показує, як впливають на убіквітин-лігазну функцію BRCA1 амінокислотні заміни в кожній з 103 амінокислотних позицій дослідженого фрагмента білка. Амінокислотні позиції розташовані вздовж горизонтальної осі і підписані в нижній частині діаграми. Для кожної позиції різними кольорами показані ефекти різних замін. За вертикальної осі відкладені 20 амінокислот, якими дослідники по черзі замінювали вихідну амінокислоту в кожній позиції. жовтими прямоугольничками відзначені амінокислоти «дикого типу», тобто ті, які стоять в даній позиції в нормальному, що не мутантному білку. Синій колір позначає ослаблення функції, червоний – її посилення вище нормального рівня, білий – збереження вихідного рівня активності білка (див. колірну шкалу справа; одиниця відповідає вихідному стану, тобто «нормі»). нарешті, сірий колір позначає, що для даної заміни дані не були отримані. За кількістю білих і майже білих прямоугольничков можна судити про толерантність даного білка до мутацій, тобто про спектр несинонимичной (що ведуть до заміни амінокислоти) мутацій, які не призводять до драматичних змін його функціональності. Зображення зі статті L. M. Starita et al., 2015. Massively parallel functional analysis of BRCA1 RING domain variants

Дане дослідження, з одного боку, вражає своєю грандіозністю, з іншого – наводить на сумні думки про те, скільки ж сил потрібно витратити, щоб отримати хоча б такі простенькі, однокрокові "адаптивні ландшафти" (див.Fitness landscape) для всіх людських білків і всіх одиничних несинонимичной мутацій, не кажучи вже про їх комбінаціях. Але тим не менше ця робота необхідна, якщо ми хочемо наблизитися до відповіді на ключове питання про співвідношення генотипу і фенотипу. Без такого знання ми не зможемо розробити технології, які дозволять в майбутньому замінити слабшає природний відбір цілеспрямованим редагуванням генома, зупинити накопичення генетичного вантажу і навіть, може бути, поліпшити людську природу.

джерело: Jay Shendure and Joshua M. Akey. The origins, determinants, and consequences of human mutations // Science. 2015. V. 349. P. 1478-1483.

Див. також:
У шимпанзе, як і у людей, число мутацій у потомства залежить від віку батька, "Елементи", 18.06.2014.

Олександр Марков


Like this post? Please share to your friends:
Залишити відповідь

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: